CRISPR/Cas9基因編輯技術已廣泛應用于多種物種和領域的研究，顯著提高了基因組編輯的效率。傳統(tǒng)的sgRNA傳遞方法包括質粒轉染和慢病毒感染，但存在基因插入和免疫反應的風險。目前，直接將Cas9和sgRNA形成的核糖核蛋白（RNP）轉導到細胞中，具有更安全、更快速、脫靶效應更低、編輯效率更高的優(yōu)勢。這種方法正逐漸成為CRISPR/Cas9技術更有效的選擇。
泓迅生物提供專業(yè)的合成技術，可為基因編輯研究人員提供兩種策略的sgRNA合成服務：化學合成和體外轉錄。
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圖1. Cas9-sgRNA復合物 |
圖2. sgRNA的二級結構 |
泓迅生物CRISPR-Cas9 sgRNA設計中心針對小鼠的多個基因各設計8個sgRNA后進行體外sgRNA轉錄實驗，實驗周期短至2天，制備量達10-20μg，可以極快地滿足相關細胞學實驗的一般需求。
一步法合成gRNA DNA模板
1. 將gRNA DNA模板平連至pUC57載體測序，比對結果與設計序列一致。如圖1所示。
圖1.平連結果與設計序列比對圖
2. 將通過體外轉錄得到的sgRNA在2%的瓊脂糖中進行電泳，可以看到清晰條帶。如圖2所示。
圖2. sgRNA瓊脂糖凝膠電泳圖
3. 我們對其中一條sgRNA序列進行驗證： 先將sgRNA逆轉錄獲得cDNA，設計sgRNA擴增引物，經(jīng)過PCR反應獲得sgRNA的DNA序列；其次將DNA序列平連至pUC57載體進行測序，結果顯示sgRNA序列正確。如圖3所示。
圖3. sgRNA序列驗證瓊脂糖凝膠電泳圖
注：Lane1是sgRNA 逆轉錄cDNA；Lane2是經(jīng)DNaseI處理的sgRNA；Lane3是體外轉錄的DNA模板
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